近年來，基于高通量測序的基因組拷貝數(shù)變異測序技術(shù)（Copy Number Variation sequencing，CNV-seq）可對染色體數(shù)目異常、大片段缺失/重復及致病性拷貝數(shù)變異進行檢測，在產(chǎn)前診斷、輔助生殖、兒科遺傳病輔助診斷等領(lǐng)域得到了廣泛應(yīng)用。
為助力臨床精準診斷，博奧晶典在常規(guī)CNV-seq檢測23對染色體非整倍體和>100Kb染色體拷貝數(shù)變異的基礎(chǔ)上進行優(yōu)化升級，同步推出檢測試劑盒（RUO）和LDT檢測服務(wù)。CNV-seq plus不僅能實現(xiàn)特定UPD檢測、三倍體檢測和母源污染鑒定，還能為臨床提供本土化樣本檢測、數(shù)據(jù)解讀和報告生成的一體化解決方案，進一步助力臨床提高診療效率。
CNV-seq檢測ROH的目的：篩查UPD
什么是ROH？
基因組純合區(qū)域（regions of homozygosity, ROH）是指基因組區(qū)域中一定范圍內(nèi)連續(xù)呈現(xiàn)的雜合性丟失的現(xiàn)象。對于大部分的二倍體細胞如人類體細胞，擁有兩份基因組，一份來自于父親，另一份來自于母親。在某一個等位基因位點上，如果來自父本和母本的堿基不同時，則該位點為雜合（heterozygous）；如果因為某種機制（如遠親關(guān)系或近親關(guān)系婚姻或基因轉(zhuǎn)換）導致在一定范圍內(nèi)連續(xù)的等位基因序列都是純合子而無雜合子（拷貝數(shù)仍為 2 個），則該區(qū)域為ROH。如檢出多條染色體上均存在大片段 ROH 時需考慮父母親緣關(guān)系（consanguinity）；如果僅在一條染色體發(fā)現(xiàn)≥10Mb的ROH，應(yīng)優(yōu)先考慮單親二體（uniparental disomy，UPD）的可能【1,2】。
什么是UPD？
UPD是指一個個體的兩條同源染色體都來自同一親本，或來自父母一方的染色體片段被另一方的同源部分取代。UPD的產(chǎn)生機制主要有三體細胞自救、單體細胞的自身復制（單體自救）等【3】。Nakka等【4】對440多萬份樣本研究后發(fā)現(xiàn)，UPD在活產(chǎn)兒中的發(fā)生率可達1/2000。當UPD出現(xiàn)在基因印記區(qū)域時，子代可能會遺傳兩個均有表達活性的等位基因，也可能遺傳兩個表達沉默的等位基因，從而導致基因劑量表達異常。
目前已知當?shù)?6、7、11、14、15及20號染色體存在UPD時，可通過基因組印跡障礙導致疾病的發(fā)生【5】。常見的UPD綜合征及主要表型詳見表1，其中Angelman 綜合征發(fā)病率約為1/20,000-1/12,000【6】，臨床表型包括小頭，共濟失調(diào)，癲癇，智力發(fā)育遲滯，語言能力差，微笑面容。
為什么要檢測UPD？
大多數(shù)染色體UPD沒有臨床表型，當UPD發(fā)生在印記基因區(qū)域則會導致印記基因異常，出現(xiàn)異常的表型。目前針對上述UPD綜合征（表1）尚無有效的治療手段，因此，早發(fā)現(xiàn)、早診斷、早干預對于此類疾病的防控尤為重要。
產(chǎn)前篩查或診斷中如果發(fā)現(xiàn)涉及第 6、7、11、14、15及20號染色體的嵌合、NIPT篩查三體高風險或相關(guān)超聲異常（如父源性14號染色體UPD的特殊鐘形胸廓）或涉及14、15號染色體的羅伯遜易位、平衡易位等，應(yīng)考慮進行UPD檢測。2020年ACMG指南發(fā)布了關(guān)于UPD產(chǎn)前診斷的聲明【7】，建議對如下人群在產(chǎn)前診斷時應(yīng)檢測UPD：孕婦高齡；采用PGT助孕，打算植入有印記染色體嵌合胚胎；穿刺絨毛或穿刺羊水提示印記染色體三體或單體嵌合；產(chǎn)前超聲異常與某種UPD疾病表型一致；絨毛穿刺或羊水穿刺提示存在遺傳的或新發(fā)的涉及14號或15號染色體的羅氏易位或者等臂染色體；新發(fā)的小標記染色體（sSMC），但不帶有明顯常染色質(zhì)；發(fā)生在非羅氏易位的印跡染色體的3：1分離可能導致三體或單體挽救或配子補救。
UPD的檢測方法
UPD的檢測方法主要包括STR分型技術(shù)、SNP分型技術(shù)、甲基化PCR與甲基化MLPA 技術(shù)。其中最為經(jīng)典的是STR分析，但通常不用于一線篩查，商業(yè)化的STR檢測試劑盒僅檢測特定的STR位點，難以覆蓋常見的UPD綜合征。基于SNP分型的UPD檢測技術(shù)主要包括染色體微陣列分析技術(shù)（chromosomal microarray analysis, CMA）、全外顯子組測序等方法，通過分析SNP位點的雜合性識別ROH，僅適用于單親同二體型的UPD檢測，檢測靈敏性和分辨率與SNP探針的密度和分布有關(guān)。甲基化PCR和MLPA技術(shù)直接針對目標UPD綜合征相關(guān)的關(guān)鍵印記基因的甲基化狀態(tài)進行分析，對于病因的確診有重要意義，通常用于UPD驗證。
打破技術(shù)局限，博奧晶典自主研發(fā)基于CNV-seq測序數(shù)據(jù)的ROH檢測系統(tǒng)
CNV-seq技術(shù)是基于低深度全基因組測序的新一代拷貝數(shù)變異檢測方法，具有通量高、操作簡便、兼容性高等優(yōu)勢，對于小的CNV以及低比例嵌合的CNV具有良好的檢測效能，在臨床得到了廣泛的應(yīng)用。但是，業(yè)內(nèi)普遍認為CNV-seq技術(shù)僅適用于染色體拷貝數(shù)變異的檢測，無法檢測單親二倍體UPD在內(nèi)的ROH，這在一定程度上限制了CNV-seq在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用。2019年4月發(fā)布的《低深度全基因組測序技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用專家共識》【8】建議，臨床高度懷疑胎兒為單親二倍體時，應(yīng)結(jié)合STR或 SNP array等技術(shù)進行檢測。
目前臨床應(yīng)用的CNV-seq測序技術(shù)覆蓋的SNP位點reads的平均深度1X左右，難以識別UPD和ROH。通過提高測序深度，或基于高深度測序法雖然可以解決UPD和ROH的檢測問題，但測序成本會隨著測序深度的增加而大幅增加。因此，如何使用低測序深度的數(shù)據(jù)滿足ROH/UPD的檢測需要，是一項極具挑戰(zhàn)的工作。
針對上述難題，博奧晶典的研究科學家們開發(fā)了基于全基因組低深度測序CNV-seq的ROH檢測技術(shù)，此項技術(shù)于2020年8月獲發(fā)明專利授權(quán)（ZL202010896507.5）。本方法基于生物信息學分析方法的創(chuàng)新實現(xiàn)ROH的檢測，在不增加測序深度、測序成本和實驗操作的情況下，能支持深度低至0.1~0.2X的ROH檢測。研究組基于臨床CNV-seq 0.15~0.4X的測序深度數(shù)據(jù)開創(chuàng)性地提出SNP混合雜合度指標（SMHS）的計算方法，表明在極低測序深度下（低至0.2X覆蓋深度），雖然每個SNP位點的基因型不可知，但是通過合并計算N個SNP雜合信息，計算SMHS得分可以檢測多倍體和ROH。該算法打破了現(xiàn)有低平均測序深度數(shù)據(jù)不能用于判斷ROH和多倍體的局限，這意味著不增加檢測數(shù)據(jù)量的條件下就可以分析多倍體和ROH區(qū)域，不僅能顯著降低檢測成本還能縮短檢測周期，給產(chǎn)前診斷工作和社會帶來巨大效益。
圖1 博奧晶典基于CNV-seq測序數(shù)據(jù)檢測多倍體和基因組純合區(qū)域ROH的系統(tǒng)專利技術(shù)
博奧晶典CNV-seq系列產(chǎn)品全面升級，在原有產(chǎn)品檢測23對染色體非整倍體、100Kb以上缺失/重復的基礎(chǔ)上，新開發(fā)了特有的生信算法并獲得專利授權(quán)，新增基因組純合區(qū)域ROH檢測，可提示全基因組UPD和10種>10Mb的致病性ROH；此外，博奧晶典自主研發(fā)的基于BES4000的SNP分型技術(shù)有效提示三倍體異常和定量鑒定5%以上的樣本交叉污染，為臨床提供更具性價比的檢測產(chǎn)品，為出生缺陷精準防控提供更全面的解決方案。
升級產(chǎn)品介紹
參考文獻
[1] Armour CM , Dougan SD , Brock JA , et al. Practice guideline: joint CCMG-SOGC recommendations for the use of chromosomal microarray analysis for prenatal diagnosis and assessment of fetal loss in Canada[J]. Journal of Medical Genetics, 2018, 55(4): 215-221.
[2] Papenhausen P, Schwartz S, Risheg H, et al. UPD detection using homozygosity profiling with a SNP genotyping microarray[J]. Am J Med Genet A, 2011, 155A(4): 757-768.
[3] 劉維強, 孫路明, 沈亦平. 染色體三體、嵌合體及單親二體的產(chǎn)前診斷和遺傳咨詢[J].中國產(chǎn)前診斷雜志(電子版),2020,12(02):1-5.
[4] Nakka P, Smith SP, O'Donnell-Luria AH, et al. Characterization of Prevalence and Health Consequences of Uniparental Disomy in Four Million Individuals from the General Population[J]. Am J Hum Genet, 2019, 105(5):921-932.
[5] Gaudio DD, Shinawi M, Astbury C, et al. Diagnostic testing for uniparental disomy: a points to consider statement from the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG)[J]. Genet Med, 2020, 22(7):1133-1141.
[6] Dagli A, Buiting K, Williams CA. Molecular and Clinical Aspects of Angelman Syndrome[J]. Mol Syndromol,201, 2(3-5): 100-112.
[7] Gaudio DD, Shinawi M, Astbury C, et al. Diagnostic testing for uniparental disomy: a points to consider statement from the American College of Medical Genetics and Genomics (ACMG)[J]. Genetics in Medicine, 2020, 22(7): 1133-1141.
[8] 中華醫(yī)學會醫(yī)學遺傳學分會臨床遺傳學組, 中國醫(yī)師協(xié)會醫(yī)學遺傳醫(yī)師分會遺傳病產(chǎn)前診斷專業(yè)委員會, 中華預防醫(yī)學會出生缺陷預防與控制專業(yè)委員會遺傳病防控學組. 低深度全基因組測序技術(shù)在產(chǎn)前診斷中的應(yīng)用專家共識[J]. 中華醫(yī)學遺傳學雜志,2019; 36(4): 293-296.
